Σε ένα γραμμικό μόριο DNA με 2500 ζεύγη νουκλεοτιδίων, επιδρούμε με την EcoRI και προκύπτουν δύο κομμάτια. Το πρώτο έχει 1800 νουκλεοτίδια, από τα οποία το 18% είναι νουκλεοτίδια κυτοσίνης. Αν ο συνολικός αριθμός των νουκλεοτιδίων αδενίνης στο μόριο είναι 800, να βρεθούν:
α. η σύσταση βάσεων των νουκλεοτιδίων και οι δεσμοί υδρογόνου στο πρώτο κομμάτι.
β. η σύσταση βάσεων των νουκλεοτιδίων στο δεύτερο κομμάτι.
γ. αν μπορούν τα κομμάτια να κλωνοποιηθούν μέσω φορέα κλωνοποίησης.
Λύση…
Το περιοριστικό ένζυμο EcoRI αναγνωρίζει την αλληλουχία
|
5′ |
G |
A |
A |
T |
T |
C |
3′ |
||
|
3′ |
C |
T |
T |
A |
A |
G |
5′ |
και κόβει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μεταξύ των γειτονικών νουκλεοτιδίων γουανίνης και αδενίνης. Έτσι, προκύπτουν τμήματα DNA με μονόκλωνα άκρα στα σημεία κοπής, όπως φαίνεται παρακάτω:
|
5′ |
… |
G |
A |
A |
T |
T |
C |
… |
3′ |
||||||||||
|
3′ |
… |
C |
T |
T |
A |
A |
G |
… |
5′ |
Εφόσον προέκυψαν δύο κομμάτια DNA μετά το κόψιμο, στο γραμμικό μόριο DNA υπάρχει μία αλληλουχία αναγνώρισης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης EcoRI.
α. Το πρώτο κομμάτι αποτελείται από 1800 νουκλεοτίδια. Όπως φαίνεται παραπάνω, 4 νουκλεοτίδια (2 με αδενίνη και 2 με θυμίνη) βρίσκονται στο μονόκλωνο άκρο του κομματιού. Αυτό σημαίνει πως ζεύγη συνιστούν τα 1800 – 4 = 1796 νουκλεοτίδια. Για την ακρίβεια, συνιστούν 1796 / 2 = 898 ζεύγη νουκλεοτιδίων.
Το 18% των 1800 νουκλεοτιδίων του πρώτου κομματιού, που αντιστοιχεί σε 324 νουκλεοτίδια, έχουν ως βάση την κυτοσίνη. Λόγω συμπληρωματικότητας, 324 θα είναι και τα νουκλεοτίδια γουανίνης.
[Ας μην ξεχνάμε πως τα νουκλεοτίδια κυτοσίνης και γουανίνης βρίσκονται μόνο στη δίκλωνη έκταση (και όχι στο μονόκλωνο άκρο) του πρώτου κομματιού, οπότε μπορούμε άφοβα να εφαρμόζουμε για αυτά την αρχή της συμπληρωματικότητας]
Έχουμε, λοιπόν, 324 ζεύγη C-G. Τα υπόλοιπα ζεύγη, δηλαδή 898 – 324 = 574, θα είναι ζεύγη Α-Τ. Αναλύοντάς τα, θα λέγαμε ότι 574 είναι τα νουκλεοτίδια αδενίνης και ισάριθμα είναι τα νουκλεοτίδια θυμίνης. Οφείλουμε, όμως, να προσθέσουμε και τα 4 νουκλεοτίδια (2 με αδενίνη και 2 με θυμίνη) του μονόκλωνου άκρου, για να καταλήξουμε τελικά στο ακριβές αποτέλεσμα:
574 + 2 = 576 νουκλεοτίδια αδενίνης
574 + 2 = 576 νουκλεοτίδια θυμίνης
Σε ό,τι αφορά τους δεσμούς υδρογόνου, θα πρέπει να λάβουμε υπόψη μόνο τα ζεύγη βάσεων και όχι το μονόκλωνο άκρο. Δύο δεσμοί υδρογόνου αναπτύσσονται σε κάθε ζεύγος Α-Τ. Οι δεσμοί υδρογόνου σε κάθε ζεύγος C-G είναι τρεις. Άρα:
2 × 574 = 1148 δεσμοί υδρογόνου στα ζεύγη Α-Τ
3 × 324 = 972 δεσμοί υδρογόνου στα ζεύγη C-G
Ο συνολικός αριθμός δεσμών είναι 1148 + 972 = 2120.
β. Για να βρούμε τον αριθμό νουκλεοτιδίων του δεύτερου κομματιού, θα αφαιρέσουμε τα νουκλεοτίδια του πρώτου κομματιού από τα συνολικά νουκλεοτίδια του αρχικού μορίου. Το αρχικό μόριο αποτελείται από 2500 ζεύγη νουκλεοτιδίων ή 5000 νουκλεοτίδια. Άρα, τα νουκλεοτίδια του δεύτερου κομματιού θα είναι 5000 – 1800 = 3200.
Εφόσον στο αρχικό μόριο DNA υπάρχουν συνολικά 800 νουκλεοτίδια αδενίνης, από τα οποία τα 576 (βλ. προηγούμενο ερώτημα) ανήκουν στο πρώτο κομμάτι, τα 800 – 576 = 224 θα ανήκουν στο δεύτερο. Ισάριθμα θα είναι και τα νουκλεοτίδια θυμίνης, γιατί, όπως εξηγήθηκε και παραπάνω, στο μονόκλωνο άκρο του κομματιού υπάρχουν 2 νουκλεοτίδια αδενίνης και 2 νουκλεοτίδια θυμίνης.
[Αυτό, πρακτικά, σημαίνει πως τα ζεύγη Α-Τ θα είναι 222]
Αφαιρώντας τα νουκλεοτίδια αδενίνης και θυμίνης από το συνολικό αριθμό νουκλεοτιδίων, βρίσκουμε το άθροισμα νουκλεοτιδίων γουανίνης και κυτοσίνης:
3200 – (224 + 224) = 2752
Λόγω συμπληρωματικότητας, 2752 / 2 = 1376 θα είναι τα νουκλεοτίδια γουανίνης, αλλά και κυτοσίνης.
γ. Τα κομμάτια έχουν μονόκλωνα άκρα μόνο στη μία πλευρά τους, εκεί όπου επέδρασε η EcoRI. Eπομένως, δεν είναι δυνατή η κλωνοποίηση τους. Χρειάζονται μονόκλωνα άκρα και στις δύο πλευρές των κομματιών, για να μπορέσουν να ενσωματωθούν σε φορέα κλωνοποίησης “ανοιγμένο” με το ίδιο περιοριστικό ένζυμο.